Tesis EP Genética y Biotecnología

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Evolución del complejo de especies Bostryx modestus basado en el gen de la Citocromo C oxidase subunidad I del genoma mitocondrial
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2009) Chumbe Mendoza, Ana Luz; Ramírez Mesías, Rina Lastenia
El desierto costero del Perú alberga diversidad de especies de moluscos terrestres, los que conservan en su genoma toda una historia de cambios ambientales. Al evaluar genéticamente especies de distribución restringida en este tipo de escenarios se podría inferir su desarrollo histórico. Bostryx es uno de los géneros más ampliamente distribuidos en el occidente peruano; tres especies de este género conforman el llamado complejo de especies Bostryx modestus, que incluye a Bostryx modestus, Bostryx sordidus y Bostryx scalariformis, principalmente distribuidos en el ecosistema de Lomas. Con la finalidad de dilucidar las relaciones evolutivas de este complejo y asignar posibles perfiles COI a las mencionadas especies, se usó el marcador mitocondrial Citocromo Oxidasa subunidad I (COI), marcador estrella en el desarrollo del código de barras de la vida. Se usaron 21 ejemplares de B. modestus, B. sordidus y B. scalariformis, de diferentes zonas de Lima, además de ejemplares de B. conspersus, B. turritus y Scutalus spp. como grupo externo. Se obtuvo DNA total de tejido muscular del pie (2 mm3 ) de dichos individuos. Posterior a estandarizar la amplificación de COI en estas especies endémicas de la costa peruana, se procedió a la amplificación y secuenciamiento de las mismas. Las 29 secuencias obtenidas colapsaron en 19 haplotipos, uno de los cuales fue compartido por tres individuos de Bostryx sordidus y un Bostryx modestus (srStmd). Los demás haplotipos fueron únicos por especie, incluyendo un haplotipo muy divergente de Bostryx modestus de las Lomas de Picapiedra (mdPiL). La hipótesis evolutiva estimada por cuatro metodologías distintas: Neighbor-joining (NJ), Máxima Parsimonia (MP), Máxima verosimilitud (Maximum Likelihood, ML) e Inferencia Bayesiana (IB), mostró una topología similar en todos los casos con 13 de los 14 ejemplares de B. modestus, B. sordidus y B. scalariformis formando un grupo monofilético; dentro de este clado no se encontraron grupos monofiléticos por especie, impidiendo la obtención de perfiles COI. El tiempo de divergencia estimado para las especies B. modestus, B. sordidus y B. scalariformis resultó en el Pleistoceno (1.382 millones de años), época de grandes ciclos glaciales e interglaciales. La diversidad genética actual del grupo genera una topología de “árbol en estrella”, marca indiscutible de un modelo demográfico de cuello de botella genético seguido de súbita expansión demográfica, demostrando que el desierto peruano ha pasado por periodos de exuberancia producidos probablemente por paleo eventos El Niño/Oscilación Sur. El marcador COI no consiguió definir los límites de las especies B. modestus, B. sordidus y B. scalariformis, generando un árbol polifilético debido a diversificación reciente más que a la carencia de sensibilidad de este marcador. La costa peruana se muestra como un ambiente generador de diversidad biológica que merece ser preservado, para conservar la salud del ecosistema.
Aislamiento, caracterización y análisis del ADN codificante de la glicoproteína de zona pelúcida de tipo 2 (aZP2) de alpaca (Lama pacos)
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2009) Pérez Gamarra, Susan Karen; Valdivia Cuya, Martha Esther
La Zona Pelúcida es la matriz extracelular que rodea a los ovocitos de vertebrados, cumple roles trascendentales en la reproducción, incluyendo el reconocimiento y unión de gametos especie-específico, inducción de la reacción acrosómica (RA) del espermatozoide, el bloqueo de la poliespermia, mantiene la integridad del embrión temprano durante su transición por el oviducto; está constituida por tres glicoproteínas: ZP3 que induce RA; ZP1, estructural, que interconecta a ZP3 y ZP2. ZP2 es la molécula de unión secundaria, interactúa con los receptores espermáticos expuestos después de RA siendo necesaria para mantener la unión del espermatozoide al ovocito, su modificación proteolítica después de la fertilización permite el bloqueo de la poliespermia. ZP2 participa también en la organización, el desarrollo y maduración del ovocito, puesto que mantiene consistente la matriz y la interacción entre las células periféricas y la célula germinal. Se caracterizó y analizó in silico la secuencia codificante parcial de la glicoproteína de Zona Pelúcida tipo 2 (aZP2) en alpacas, se determinó que esta proteína se expresa exclusivamente en los ovarios. Además está secuencia parcial analizada se encuentra conservada, constituyéndose un grupo monofilético entre los Cetarteodactyla. La presente Tesis aporta conocimiento básico sobre la glicoproteína aZP2 en alpacas, proteína implícita en la fecundación, conocerla implícitamente beneficia el mejoramiento de las actuales técnicas biotecnológicas reproductivas tales como la maduración folicular-ovocitaria, criopreservación de gametos y embriones, fertilización in vitro e inyección intracitoplasmática del espermatozoide, técnicas que se intentan aplicar con muchas dificultades en camélidos.
Colonización intraluminar testicular de células madres germinales a partir de células madre pluripotentes obtenidas de la masa celular interna en ratones
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2010) Acosta Campos, Láyonal Germán; Pino Gaviño, José Luis Rafael
La terapia celular de células madre pluripotentes o embrionarias utilizada por la medicina regenerativa es un protocolo recientemente aplicado. Estas células, son derivadas de la masa celular interna (MCI) del estadio de blastocisto y son capaces de diferenciarse en todos los linajes celulares del cuerpo. Por otro lado, el tratamiento de enfermedades crónicas como el cáncer requiere de potentes fármacos que, en ocasiones, producen efectos no deseados. Ciclofosfamida (CP) es una droga anticancerígena alquilante que, entre otras cosas, provoca como efecto secundario infertilidad. El objetivo de la presente investigación fue revertir dicho efecto negativo, mediante terapia celular, utilizando células de la MCI al diferenciarse in vivo en células madre germinales (CMG). Se utilizaron blastocistos de ratones albinos Swiss Rockefeller obtenidos a las 90 h post cópula. La MCI fue aislada mediante inmunocirugía y luego trasplantada a los túbulos seminíferos de ratones receptores C57BL, a los que previamente se les disminuyó drásticamente la línea germinal con CP (220mg/kg pc). Los animales receptores fueron mantenidos por 35 días en un bioterio en condición estándar; luego los animales fueron sacrificados por dislocación cervical, se extrajeron los testículos para evidenciar la colonización y diferenciación de la MCI mediante cortes histológicos seriados. La evaluación comprobó colonización intraluminal y presencia de minitúbulos (2%) en el 62.5% de los receptores transplantados. Se demostró que las células de la MCI tienen la capacidad de colonizar túbulos seminíferos de ratones adultos de diferentes cepas. Palabras claves: Colonización intraluminal, Masa Celular interna, Células Madre Pluripotentes, Células Madre Germinales, Minitúbulos.
Ayudando a descifrar el enigma taxonómico, el código de barras de ADN de Megalobulimus spp. (Mollusca, Gastropoda) del departamento de San Martín - Perú
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2010) Congrains Castillo, Carlos; Ramírez Mesías, Rina Lastenia
Dentro de la gama de especies de la selva peruana, se encuentran caracoles terrestres de la familia Megalobulimidae (Mollusca, Gastropoda), entre las que destacan Megalobulimus popelairianus, Megalobulimus huascari y Megalobulimus capillaceus, que tienen importancia económica por las propiedades nutricionales de su carne y cosméticas de su baba. Este trabajo tuvo por objetivo principal desarrollar perfiles de ADN de los Megalobulimidae de San Martín, que hagan posible su reconocimiento a nivel específico y estudiar su salud genético poblacional mediante la diversidad genética, todo ello para garantizar su uso sustentable y eventualmente certificar a estas especies en el biocomercio peruano. Se evaluaron 65 muestras biológicas que fueron colectadas en septiembre de 2007 y enero, febrero y marzo de 2008. Se realizó la extracción de ADN con el método del CTAB y cloroformo, alcohol-isoamílico a partir de tejido muscular de pie. Se amplificaron y secuenciaron regiones de los genes rRNA y Citrocromo C oxidasa subunidad I (COI) del genoma mitocondrial con primers internos y universales, respectivamente. Las secuencias de ADN fueron alineadas, caracterizadas, se determinó la calidad de los datos, distancias genéticas, diversidad genética, se realizó la reconstrucción filogenética con NJ, MP, ML e BI y se analizaron los perfiles de ADN. La tasa de éxito de amplificación del COI fue inferior a la del rRNA. Sorprendentemente, las 31 secuencias de ADN de M. capillaceus no mostraron ninguna variante genética. Los ejemplares de difícil identificación entre M. huascari y M. popelairianus (rotulados como Megalobulimus spp.) mostraron bajos valores de divergencia genética (menores al 2%) con M. huascari, además que formaron grupos monofiléticos estadísticamente bien sustentados con el gen COI con todos los métodos utilizados. Las filogenias con el rRNA fueron poco concluyentes y variaron según las metodologías. Los datos combinados de ambos genes arrojaron árboles filogenéticos no resueltos. La carencia de diversidad genética de M. capillaceus, que muy probablemente haya sido producida por la sobreexplotación, pone en riesgo su supervivencia como especie.
Evaluación de marcadores moleculares Ilps y Strs heterólogos en la anchoveta peruana Engraulis Ringens para estudios poblacionales
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2011) Rojas Málaga, Diana Elizabeth; Quiroz Bazán, Roger Walter
A pesar de la importancia económica de la anchoveta peruana, Engraulis ringens, en nuestro país, no existe información acerca de la variabilidad y estructura genético poblacional de esta especie, principalmente porque no se han identificado marcadores moleculares específicos Por esta razón, se evaluó la utilidad de cinco marcadores moleculares para la caracterización molecular de la anchoveta peruana: dos microsatélites, Ee10 y Ee2, reportados en la anchoveta europea E. encrasicolus, y tres marcadores intrónicos, basados en el polimorfismo en longitud: el intrón 3 de la cadena ligera de la miosina Mlc-3, el intrón 7 de la creatina quinasa Ck-7 y el intrón 5 de la hormona de crecimiendo Gh-5. Dos de ellos, el microsatélite Ee2, y el marcador intrónico Gh-5, no amplificaron en esta especie. Para el locus Ee10, se encontraron altas probabilidades de existencia de alelos nulos, 0.2005-0.7420, lo que explicaría el déficit significativo de heterocigotos encontrado. Basándose en la heterocigosidad, se reporta un nivel bajo de polimorfismo para Mlc-3 y un nivel alto para Ck-7. Los resultados muestran que sólo Ck-7 puede ser utilizado en futuros estudios poblacionales. Este marcador sugiere que las seis capturas colectadas a lo largo del litoral peruano, una del stock norte (Salaverry) y cinco del centro (Callao, Huacho, Supe y Pisco), constituyen una misma unidad reproductiva, desde un punto de vista genético. -- Palabras clave: Anchoveta peruana, marcador intrónico, marcador microsatélite, amplificación cruzada, EPIC-PCR, estudios genéticos
Efecto de las bajas temperaturas durante una noche sobre los glúcidos de reserva de la inflorescencia de la vid (Vitis vinifera L.) CV. “Pinot Noir“
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2011) Céliz Mendiola, Vanessa; Velásquez Reinoso, Margarita Rosa Eugenia
La exposición de las plantas de vid a bajas temperaturas es uno de los factores que provocan la “coulure”. Este fenómeno involucra la aparición de perturbaciones a nivel de la fotosíntesis y el metabolismo del carbono de la planta. Con el fin de analizar el efecto de una noche fría sobre el contenido de los azúcares de reserva de las inflorescencias de Pinot noir, se expusieron ramas fructíferas de esta cepa de vid a temperaturas de 4°, 0° y -3°C durante una noche, para posteriormente determinar el contenido de glúcidos (glucosa, fructosa, sacarosa y almidón) de las inflorescencias. En paralelo, se realizaron observaciones microscópicas de las reservas amiláceas de las inflorescencias sometidas a una noche a -3°C. Los resultados de este estudio muestran que los contenidos en glucosa y fructosa de las inflorescencias fluctúan durante las primeras horas luego de un estrés de 4° y 0°C. Sin embargo, es sobre todo luego de una noche a -3°C que se pudo constatar una fuerte movilización y consumo de los azúcares de reserva contenidos en las inflorescencias estresadas. -- Palabras clave: Estrés frío, glúcidos, inflorescencia, vid, coulure.
Estudio de los polimorfismos G2848A y T-1237C del gen TLR9 en dos poblaciones con enfermedad inflamatoria intestinal (eii) del sur de Brasil
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2011) Valverde Villegas, Jacqueline María; Maturrano Hernández, Abelardo Lenin
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) se divide en la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC), las cuales corresponden a una serie de patologías inflamatorias de etiología multifactorial que afectan principalmente el tracto intestinal. En los últimos años, la incidencia de estas enfermedades ha aumentado en Brasil y en poblaciones occidentales. Los genes de la familia de los Toll-like receptors (TLRs) tienen un papel importante en la regulación intestinal, principalmente en la señalización pro-inflamatoria en respuesta a distintos ligandos bacterianos y en la estimulación de diversas respuestas inflamatorias que causan una inflamación intestinal aguda y crónica. Algunos estudios consideraron al gen TLR9 (receptor que reconoce el ADN) y han encontrado que ciertos polimorfismos están asociados a esta enfermedad. Por ello, este gen es considerado como candidato para susceptibilidad en el desarrollo de la EII. Debido a que en Brasil todavía no ha sido estudiada la relación de estos polimorfismos con las EII, el objetivo del presente estudio fue analizar la frecuencia de los polimorfismos G2848A y T-1237C del gen TLR9 en pacientes con EII (descendientes de europeos) provenientes de 2 centros hospitalarios del sur de Brasil y su comparación con individuos sanos como grupo control. Para el análisis de las frecuencias alélicas y genotípicas se dividió a las poblaciones en 3 grupos: grupo 1, pacientes provenientes del hospital de la Pontificia Universidad Católica de Río Grande del Sur, grupo 2, pacientes provenientes del Hospital de Clínicas de Porto Alegre, y el grupo 3, pacientes provenientes de ambos centros hospitalarios. Nuestro estudio encontró un papel significativo del genotipo heterocigoto en pacientes con EII para el polimorfismo G2848A al analizarlo en el grupo 1 - control (P = 0.000002) y en el grupo 3 - control (P = 0.00057). Asimismo, se encontraron valores significativos de este polimorfismo cuando se subdividió a la población en EC y CU. Por otra parte, el polimorfismo T-1237C no tiene un valor significativo en los grupos analizados. Los resultados obtenidos muestra que el genotipo heterocigoto G/A de la variante alélica 2848A se presenta como un factor de susceptibilidad en la enfermedad inflamatoria intestinal en la población evaluada. Palabras claves: EII, gen TLR9, polimorfismos, susceptibilidad, asociación
Purificación y caracterización de una lectina tipo C del veneno de la serpiente peruana Lachesis muta “Shushupe“
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2011) Palomino García, Mercedes del Pilar; Lazo Manrique, Fanny Elizabeth
Expone que se ha purificado la lectina verdadera aislada del veneno de Lachesis muta y se han determinado sus propiedades bioquímicas y biológicas. La purificación se logró utilizando como único paso cromatográfico una columna de DEAE-Sephadex A-50. La proteína no enzimática fue reconocida debido a su capacidad para aglutinar glóbulos rojos humanos. La purificación obtenida fue de 3,6 veces y la lectina representó el 3,5 % respecto a la proteína total. El análisis por PAGE-SDS, demostró que la lectina de L. muta tiene un peso molecular de 27,5 kDa en su forma dimérica y 14,3 kDa en su forma monomérica. La lectina tuvo mayor afinidad por la lactosa, seguida de galactosa, arabinosa, sacarosa y glucosa. Por otro lado, no puede reconocer residuos de maltosa, manosa ni fructosa. La lectina de L. muta ha sido clasificada dentro de las lectinas tipo C debido a que fue inhibida por EDTA, DTT y 2β-ME y la inhibición causada por 0,125 - 0,5 mM de EDTA fue anulada por los iones calcio, magnesio y manganeso. Se trata de una proteína estable al pH y a la temperatura, ya que se une a los glóbulos rojos a diferentes valores de pH (4 a 9) y tolera temperatura desde 30 hasta 70 °C. Por último, se trata de un componente no tóxico para ratones albinos, no interviene en la coagulación sanguínea, pero es reconocida por el antiveneno lachésico monovalente (INS, Lima-Perú) y por lo tanto, antigénica.
Fisiología espermática, fragmentación del ADN y niveles de expresión génica de Prm1, Prm2, Tnp1 y Tnp2 en relación a la edad en ratones
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2012) Vásquez Cavero, Jonathan Humberto; Valdivia Cuya, Martha Esther
La edad influye en el empaquetamiento adecuado de la cromatina espermática haciéndola más vulnerable con el transcurrir del tiempo. Las protaminas son las proteínas nucleares más abundantes en el espermatozoide maduro y empaquetan fuertemente el genoma paterno dentro del núcleo espermático, haciéndolo inaccesible a nucleasas o mutágenos, protegiendo de esta manera al ADN espermático. Ratones con sólo una copia de estos genes son infértiles, lo que demuestra que son esenciales para la función espermática normal. El objetivo de esta tesis fue investigar si existe relación entre la edad masculina y la protaminación espermática a nivel fisiológico y molecular. Se usaron ratones (Mus musculus Linnaeus, 1758) macho de la cepa C57BLACK6 (C57BL6) (20 – 25 g), divididos en dos grupos etarios: ratones de 3-4 meses (Grupo joven: G1) y 18-21 meses (Grupo viejo: G2). Se emplearon espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo para los análisis de movilidad espermática, fragmentación del ADN mediante el ensayo cometa bidimensional y estrés oxidativo mediante TBARS. Se utilizó tejido testicular para evaluar la expresión génica de Prm1, Prm2, Tnp1 y Tnp2, mediante PCR en tiempo real (RT-qPCR). Respecto a las velocidades de movimiento espermático se observó que el G1 presentó mayores valores que G2, en cuanto a MOT (50.63 ± 6.60 % vs 30.38 ± 5.16 %, p<0.05) y MR (24.50 ± 3.04 % vs 13.92 ± 3.02 %, p<0.05), mientras que ME fue mayor en G2 que en G1 (69.31 ± 5.31 % vs 48.38 ± 7.39 %, p<0.05). Respecto a los tipos de desplazamiento de los espermatozoides, se observó que G1 presentó mayores valores que G2 respecto a VAP (67.89 ± 5.68 % vs 52.12 ± 3.38 %, p<0.05) y VSL (43.15 ± 3.47 % vs 30.68 ± 2.45 %, p<0.05). El estrés oxidativo medido con TBARS no presentó diferencias entre el G1 y G2 (132.50 ± 9.64 ng MDA/106 spz vs 135.00 ± 10.81 ng MDA/106 spz; p>0.05). Tampoco se observaron diferencias significativas en la proporción de espermatozoides con ADN fragmentado entre los grupos G1 y G2 (20.51 ± 1.41 % vs 20.11 ± 1.29 %, p>0.05), ni en la cantidad de ADN fragmentado por espermatozoide entre ambos grupos (17.36 ± 0.49 % vs 17.76 ± 0.62 %, p>0.05). La comparación de los niveles de expresión de los genes Prm1, Prm2, Tnp1 y Tnp2 demostró que Prm2 y Tnp1 en el G2 se sobreexpresan observándose una diferencia significativa respecto al G1 (p<0.05), sin embargo, Prm1 y Tnp2 no mostraron diferencias significativas (p>0.05). Si bien el aumento de la edad presentó diferencias significativas con los niveles de expresión Prm2 y Tnp1, esto no sería suficiente para ejercer algún impacto sobre la producción de ROS y el aumento de la fragmentación del ADN espermático, debido quizás al papel protagónico de Prm1 en la protaminación espermática reportado en todas las especies estudiadas hasta la fecha y cuyos niveles de expresión no son alterados en el grupo de ratones viejos. Se concluye que el incremento de la edad no altera la protaminación espermática en ratones.
Evaluación de la resistencia al virus de PLRV mediante el mecanismo de ARN de Interferencia (ARNi) en líneas transgénicas
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2012) Orbegozo Ramírez, Jeanette Paola; Ramírez Roca, Pablo Sergio
El virus del enrollamiento de la papa (PLRV) es responsable de pérdidas severas en el rendimiento y calidad del cultivo de la papa en todo el mundo. Existen papas nativas y especies silvestres que presentan altos niveles de resistencia a PLRV (Solanum brevidens, S. tuberosum, S. chacoencse y S. raphanifolium). El desarrollo de nuevas variedades utilizando estas fuentes de resistencia es uno de los retos actuales del mejoramiento genético, sin embargo la naturaleza genética del cultivo de la papa que se desea mejorar es en la mayoría de los casos incompatible entre cultivos, sumándose a ello que la obtención de estos cultivos mejorados es cerca de 20 años. Por lo tanto la inserción directa de un gen que confiere resistencia a una variedad de importancia comercial tiene una ventaja muy significativa. En la presente tesis se evaluaron diez eventos (variedad Desiree) transformados con un constructo tipo hairpin que contenía el sistema de ARN de interferencia (ARNi), el cual mantiene activo y constante la formación del ARNdc entre las secuencias homólogas del transgen y el virus de PLRV. Los eventos fueron caracterizados por PCR y Southern blot, evidenciándose que tenían en su genoma entre una a dos copias del transgen. Los ensayos serológicos de DASELISA seleccionaron cuatro eventos con alta resistencia (bajas o nulas concentraciones del virus PLRV) durante su infección primaria, secundaria y terciaria. Finalmente, se determinó por Northern Blot que la resistencia a PLRV está relacionada con la presencia de los fragmentos pequeños de ARN (ARNsi) formados a partir del mecanismo de ARNi. -- PALABRAS CLAVE: Papa, transformación, PLRV, ARNi, ARNsi.
Diversidad genética y estructura poblacional de Megalobulimus huascari (Gastropoda: megalobulimidae), especie promisoria del biocomercio nacional
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2012) Chirinos Saire, Jenny Martha; Ramírez Mesías, Rina Lastenia
El estudio de Megalobulimus huascari abarcó diversos distritos de la provincia de Chanchamayo en el departamento de Junín, así como la provincia de Oxapampa en Pasco. Obtiene el perfil genético de M. huascari en base al marcador mitocondrial 16S rRNA, a fin de permitir su certificación molecular en el biocomercio y generar pautas para su conservación. Un segmento del genoma mitocondrial correspondiente al gen ribosomal 16S fue empleado como marcador molecular para realizar análisis filogeográficos y filogenéticos en la especie M. huascari. Se colectó muestras de 29 individuos distribuidos en siete poblaciones de los departamentos de Junín y Pasco en la Selva Central del Perú. Un total de diez haplotipos fueron hallados. Asimismo se pudo detectar niveles relativamente altos de diversidad haplotípica y niveles bajos de diversidad nucleotídica. Dos linajes distintos, A y B, fueron revelados mediante los análisis filogenéticos. La red de haplotipos (network) y el estadístico poblacional Fst indicaron ausencia de estructuración geográfica. Sin embargo, la repartición de la varianza molecular estuvo mejor explicada al hacer la agrupación a priori para los dos linajes observados en la filogenia de M. huascari. Los análisis de mismatch distribution y tests de neutralidad (Fu’Fs y Tajima) indicaron eventos de expansión poblacional para ambos linajes. La estructuración genética y distribución geográfica encontrada en las poblaciones de M. huascari puede ser atribuida a eventos tales como la orogenia de los Andes. Finalmente, el perfil 16S rRNA obtenido para M. huascari resultó ser una herramienta eficaz para la identificación de la especie a nivel molecular, lo cual permitirá optimizar las medidas relacionadas a su conservación y certificar a la especie dentro del comercio nacional.
Evaluación de la calidad espermática y ensayos preliminares en Criopreservación de espermatozoides de Lenguado Paralichthys Adspersus (Steindachner, 1867)
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2012) Montes Montes, Melissa; Valdivia Cuya, Martha Esther
La acuicultura de peces planos se ha incrementado notablemente en los últimos años, sin embargo existen disfunciones reproductivas que no permiten una reproducción exitosa en cautiverio, por lo tanto, conocer el estado reproductivo de los ejemplares así como la calidad de sus gametos es de vital importancia. La evaluación de la calidad espermática permite incrementar no solo los índices de supervivencia larval sino la aplicación de técnicas como la fecundación in vitro, el monitoreo de las condiciones de cultivo y la criopreservación con el fin de asegurar la reproducción en cautiverio. Los resultados obtenidos en relación a los parámetros de calidad espermática del lenguado Paralichthys adspersus acondicionado al cautiverio fueron el volumen espermático con 758 ± 310 µL, la concentración espermática fue de 2.49 ± 0.26 x 1010 espermatozoides/mL, la clase de motilidad fue 4.00 ± 0.26 con un porcentaje el 50 y 90 % y la viabilidad espermática se evaluó mediante dos técnicas de tinción, se obtuvo 98.31 ± 0.26 % con Eosina-Nigrosina y 87.67 ± 8.28 % con el Kit LIVE/DEAD®. Además, se realizaron ensayos preliminares en criopreservación de espermatozoides, donde se evaluó la motilidad espermática post-incubación en soluciones crioprotectoras, obteniéndose los mejores resultados con DMSO a una concentración de 1.5 M cuya clasede motilidad fue 3.04 ± 0.23 con un 51.79 ± 5.83 %. Por otro lado, la motilidad espermática luego de la criopreservación fue 12.09 ± 2.27 %, con una tasa de congelamiento de – 15 °C/min y de descongelamiento de 50 °C/min. La presente tesis se presenta como el primer reporte de la calidad espermática de Paralichthys adspersus en cautiverio, así como los primeros ensayos para la criopreservación de espermatozoides en esta especie. -- PALABRAS CLAVE: Paralichthys adspersus, espermatozoides, calidad espermática y criopreservación.
Genotoxicidad e inestabilidad genética producida por la exposición de Allium cepa a biocidas
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2012) Berrocal Huallpa, Alfredo Miguel; Siles Vallejos, María Angélica; Blas Sevillano, Raúl Humberto
El uso de biocidas es una constante en el campo agronómico, el daño ocasionado a los cultivos y por consiguiente el gran potencial de daño para los consumidores es conocido, sin embargo su uso sigue en marcha. Por ello se realizaron pruebas citogenéticas para la observación de aberraciones cromosómicas y caracterización molecular en Allium cepa usando muestras de raíces de plantas expuestas y no expuestas a biocidas. Los tratamientos se realizaron con el objetivo de comparar el grado de afectación de los biocidas sobre la mitosis y la ocurrencia de mutaciones a nivel cromosómico y molecular. El ANOVA para los datos de desarrollo radicular al finalizar la experimentación, mostraron un CV de 9.88, se observo diferencias significativas entre el control y los tratamientos, los porcentajes de inhibición llegaron a tener valores máximos de 84.2% para vertimec V8 y 76.5% para pentacloro P8, y valores mínimos de 38.2% para vertimec V0.5 y 43.8% para pentacloro P0.5. El índice mitótico fue mayor para el control (0.193) y menores para el tratamiento con menor desarrollo radicular, vertimec V8 (0.0214) y pentacloro P8 (0.0284). Las pruebas citogenéticas mostraron la ocurrencia de anomalías en el ciclo celular siendo la más frecuente la C-mitosis. Se puede concluir que el test Allium es un buen indicador de citotoxicidad y genotoxicidad. Los biocidas ocasionan cambios en la estructura genómica de un cultivo, estos cambios podría acumularse y ocasionar cambios a nivel de expresión, pudiendo dañar regiones de interés para una especie. Los AFLPs no mostraron diferencias a nivel de patrón de bandas entre el control y los tratamientos. A nivel molecular se tendría que usar marcadores moleculares más específicos, además de verificar si las regiones afectadas son al azar.
Detección molecular de secuencias nucleotídicas con alto contenido de citosinas en el gen FMR1
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2012) Lindo Samanamud, Demetrio Saúl; Mazzetti Soler, Pilar Elena
Varios microsatélites inestables se caracterizan por la presencia de nucleótidos de citosinas en sus unidades de repetición; adoptan estructuras de DNA alternativas a la convencional y en algunos casos, involucran procesos de metilación. El genotipado de tripletes por PCR convencional se fundamenta en la denaturación del DNA y posterior amplificación del triplete repetido. Sin embargo, debido las estructuras alternativas que adoptan estos microsatélites, las reacciones de denaturación y amplificación son ineficientes. En este trabajo desarrollo una alternativa de diagnóstico por PCR para secuencias ricas en citosinas (metiladas y no metiladas) basada en modificación nucleotídica. Previo consentimiento se modificó el gen del retardo mental ligado al fragilidad del cromosoma X tipo 1,cuya siglas en ingles es FMR1(Fragile X Mental Retardation 1) de ocho individuos normales (cuatro mujeres y cuatro varones) empleando bisulfito de sodio, cambiando las citosinas en uracilo. Posteriormente, con el uso de bioinformática, se realizó:1) La simulación de las estructuras alternativas que adopta el microsatélite inestable contenido en la región 5’-UTR del gen. 2) Luego de la ubicación de las islas CpG, se generaron cebadores específicos que hibriden con el microsatélite modificado (Primer T) y cebadores específicos que hibriden con una secuencia modificada del gen FMR1 que contiene las islas CpG (Primer M). Finalmente, ambas secuencias fueron amplificadas por PCR convencional. La modificación del DNA fue evidenciada por espectrofotometría al uracilo, luego de tratamiento químico con bisulfito de sodio. La estructura que fue evidenciada por métodos bioinformaticos fue la estructura llamada hairpins (Horquillas). Se encontraron dos potenciales islas CpG en la región estudiada. La amplificación con los cebadores T confirmó el diseño in silico desarrollado para abordar la estructura en hairpins y el efecto que ejerce la modificación sobre este tipo de estructura. La amplificación con los cebadores M permitió detectar metilación de la primera isla CpG del gen FMR1 en el cromosoma x inactivo. En conclusión se desarrolló un método alternativo para amplificación de secuencias de microsatélite en rango normal, que contengan citosinas metiladas y no metiladas, que permite la amplificación mediante PCR. Se requieren estudios posteriores con muestras de DNA que contengan microsatélites anormalmente expandidos (metilados y no metilados) para validar su aplicación clínica diagnóstica. -- Palabras clave: metilación, modificación nucleotídica, tripletes repetidos
Variación de las actividades biológicas y enzimáticas del veneno de la serpiente Bothrops atrox “jergón“ de tres zonas geográficas del Perú
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2012) Ortíz Rojas, César Alexander; Yarlequé Chocas, Armando
Estudia la variabilidad en las características bioquímicas y biológicas de venenos de ejemplares de B. atrox procedentes de los departamentos de Amazonas, Ucayali y Junín. A los venenos se les realizó el análisis del contenido proteico y el número de bandas por PAGE-SDS, así como las actividades de fosfolipasa A2, hemolítica indirecta, amidolítica, coagulante, hemorrágica y proteolítica sobre caseína y mediante zimografía; además se hicieron ensayos de inmunodifusión y neutralización in vitro con el suero antibotrópico polivalente del INS-Perú. Las actividades amidolítica, coagulante, y proteolítica mediante zimograma, evidenciaron variabilidad tanto entre muestras de diferentes regiones como dentro de una misma región. La actividad fosfolipasa A2 y hemolítica indirecta evidenciaron una mayor actividad en los venenos de Amazonas y una menor en los venenos de Junín. En los demás ensayos no se observaron diferencias resaltantes en las características del veneno. Con respecto a las pruebas de neutralización, ½ dosis del antiveneno fue suficiente para neutralizar con eficacia las actividades coagulante y fosfolipasa A2 de todos los venenos. Nuestros resultados indican que algunas de las propiedades del veneno de la serpiente B. atrox son variables, sin que ello afecte la capacidad neutralizante del suero antibotrópico polivalente producido por el INS.
Clonamiento y expresión de la proteína recombinante homóloga a catepsina l del metacéstodo de Taenia solium
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2012) León Janampa, Nancy; Talledo Rivera, Miguel Ángel Francisco; Sheen Cortavarría, Patricia
Taenia solium es un céstodo de vida parásita, cosmopolita y tiene como hospedero definitivo al hombre. Estos helmintos aplanados son los responsables de infestaciones frecuentes en zonas endémicas en América Latina, Asia y África, así como en naciones desarrolladas con flujo masivo de inmigrantes provenientes de áreas endémicas. La teniosis se produce cuando el hombre consume las larvas (cisticercos) de Taenia solium, mientras que la cisticercosis es causada por el consumo de los huevos. Estos últimos se desarrollan hasta cisticerco en diferentes tejidos, principalmente en el sistema nervioso central, causando la neurocisticercosis, la que se caracteriza por lesiones y diferencias en la respuesta inmunológica del huésped frente al parásito. Las manifestaciones clínicas más frecuentes son epilepsia, signos neurológicos de focalización, hipertensión endocraneal y deterioro cognitivo. En estudios realizados a partir de fluido de cisticerco se reportaron proteínas antigénicas importantes como la cisteín proteasa homóloga a catepsina L, la cual interviene en la invasividad del cisticerco, desde el tracto digestivo del hospedero hasta el músculo y sistema nervioso, a través del torrente sanguíneo. En el presente trabajo, se ha identificado el gen de una proteína similar a catepsina L de cisticerco a partir del genoma de T. solium, secuenciado en el laboratorio de Bioinformática y Biología Molecular (UPCH). La región codificante madura de la secuencia homóloga a Catepsina L fue de 633 nt, esta secuencia fue clonada y expresada en el vector pET28a; la proteína expresada de 22.3 kDa se encontró en el sedimento del lisado celular de Escherichia coli BL21 (DE3), sistema procariótico de expresión, lo cual indica que fue insoluble. Con el propósito de obtener la proteína soluble, se estandarizó la temperatura de crecimiento bacteriano, el tiempo de inducción y la concentración de IPTG, pero no fue posible lograrlo, posiblemente por las glicosilaciones postraduccionales que presenta esta proteína, y que que las bacterias no pueden realizar.
Integración de marcadores microsatélites en el mapa ultradenso de solanum tuberosum y su comparación con el de solanum phureja
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2012) Torres Ascurra, Yerisf Carla; Sotil Caycho, Giovanna Elizabeth; Orjeda Fernández, María Gisella
La papa, es el cultivo no cereal más importante del mundo con una producción mundial que ha alcanzado los 329 millones de toneladas anuales. A pesar de la enorme importancia de este cultivo, aún se desconocen aspectos sobre la genética de muchas de sus características cualitativas y cuantitativas. El mapa UHD (> 10 000 AFLPs) de Solanum tuberosum, ha sido una herramienta de gran utilidad para el proyecto de secuenciamiento del genoma de la papa, que se enfocó inicialmente en el individuo RH89-039-16. Sin embargo, debido a su heterocigocidad se optó por una línea doble monohaploide de la especie S. phureja (DM1-3516R44), para lo cual fue necesario la construcción de novo de un mapa genético. Con la finalidad de identificar cambios en la estructura genómica de estos dos individuos, se analizaron 74 marcadores microsatélites cartografiados previamente en DM1-3516R44, lográndose integrar 62 loci microsatélite en el mapa UHD de RH89-039-16. La comparación de los mapas genéticos de RH89-039-16 y DM1-3516R44 reveló la existencia de colinealidad en grandes fragmentos de los cromosomas II, V y VI, mientras que los cromosomas I, IV, X y XII presentan diferencias en cuanto al contenido de ciertos marcadores. Los cromosomas VII y IX muestran la presencia de rearreglos cromosómicos que podrían ser inversiones o translocaciones, además la presencia de loci duplicados en los cromosomas VIII, I y II, indicaría la ocurrencia de eventos de duplicación intra e intercromosómica. Sin embargo para verificar tales cambios es necesario cartografiar más microsatélites y saturar la zona cromosómica de interés. -- Palabras clave: Papa, marcador molecular, microsatélite, cartografía genética, mapa UHD, colinealidad.
Ubicación de secuencias genómicas de Solanum phureja en un mapa genético utilizando marcadores microsatélites
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2012) Martinez Corcino, Diana Susana; Velásquez Reinoso, Margarita Rosa Eugenia
El genotipo doble monoploide DM1-351644 de Solanum tuberosum Grupo phureja (DM) desarrollado por la Universidad de Virginia fue secuenciado por el Consorcio de Secuenciamiento del Genoma de la Papa (PGSC) en el Instituto de Genómica de Beijing teniendo como resultado una gran cantidad de super-scaffolds con posición genómica desconocida. Con el fin de contribuir a la orientación y posicionamiento de estos super-scaffolds se construyó un mapa genético. En este trabajo, se analizaron 100 nuevos marcadores microsatélites diseñados por el PGSC, de los cuales 37 marcadores se lograron posicionar en 12 grupos de ligamiento. Debido a la utilización de microsatélites con posición cromosómica conocida se pudo asignar estos grupos de ligamiento a los 12 cromosomas específicos de la papa. Con estos marcadores posicionados se pudieron ubicar 37 super-scaffolds, contribuyendo al conocimiento del orden de las secuencias genómicas con posición cromosómica desconocida productos del secuenciamiento del genoma de DM. El conocimiento del genoma será una herramienta importante para ser utilizada en los futuros programas de mejoramiento. Palabras claves: PGSC, super-scaffolds, microsatélites, polimofismo, segregación, distorsión, mapa genético.
Caracterización bioquímica y biológica de una hialuronato glicanohidrolasa del veneno de la serpiente peruana Bothrops brazili “Jergón shushupe”
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2012) Delgadillo Arone, Julio César; Yarlequé Chocas, Armando
Bothrops brazili conocida como “jergón shushupe” es una serpiente que habita en la selva amazónica del Perú y países vecinos. En el veneno de esta serpiente se ha encontrado una proteína con actividad hialuronato glicanohidrolasa o hialuronidasa. La purificación se realizó en dos pasos cromatográficos utilizando columnas de Sephadex G-75 y DEAE Sephadex A-50. Se obtuvo una purificación de 33 veces con un rendimiento de 54,5 % y una recuperación de proteína activa equivalente a 1,66 %. Esta enzima es una proteína básica monocatenaria con un peso molecular de 110 kDa y pH óptimo fue de 5,5. La actividad enzimática a temperatura ambiente, después de 72 horas, se mantuvo en 50 % y fue completamente inactivada a las 192 horas. La actividad de la hialuronidasa se incrementó un 38,9 % por la adición de iones magnesio (150 mM), en tanto que el EDTA, el iodoacetato y el aminoácido glicina produjeron fuertes inhibiciones. La hialuronidasa de B.brazili (HBra) es muy antigénica formando una sola línea de precipitación frente al antiveneno polivalente (INS-Perú). Se concluye que esta enzima es un factor difusor del veneno por su acción en los procesos hemolíticos y hemorrágicos ensayados in vitro e in vivo. La proteína carece de toxicidad y fue neutralizada tanto por el antiveneno botrópico polivalente como el lachésico monovalente.
Determinación de la Eficacia Inmunogénica de antígenos de Echinococcus Granulosus en perros infectados experimentalmente
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2013) Astupiña Figueroa, Elizabeth Sofía; Gavidia Chucán, César Miguel
La equinococosis quística representa una grave zoonosis parasitaria en nuestro país y otros países en desarrollo dedicados a la ganadería. El agente causante es el céstodo Echinococcus granulosus, cuyo estadio adulto se desarrolla en el intestino delgado de hospederos definitivos (caninos) y el desarrollo del estadio larval se presenta principalmente en el hígado y pulmón de hospederos intermediarios como el ganado ovino. Una vacuna que proteja a los perros permitiría disminuir la biomasa parasitaría y la carga de huevos que infecta al rebaño. Por ello se evaluó la imnunoprotección contra E. granulosus empleando de antígenos de superficie como proteínas de membrana y productos metabólicos de excreción-secreción de protoescólices, y parásitos adultos. Las proteínas de membrana fueron obtenidas por extracción con Tritón x-114 y los productos de excreción/secreción (E/S) obtenidos por cultivo in vitro (Medio HAM F12). Además, se obtuvo antígeno total de la tenia adulta por sonicación. Se usó Quil A (50 g/ml) como adyuvante. Los antígenos fueron administrados por vía intranasal y se emplearon 12 perros divididos en cuatro grupos de tratamiento: control, E/S, proteínas de membrana (PM) y proteína total. Los animales recibieron tres inmunizaciones en intervalos de 15 días; se enfrentaron con 150000 protoescólices viables por vía oral, 15 días después de la última inmunización. Los perros fueron sacrificados entre 49-53 días después del enfrentamiento. Se evaluó la carga parasitaria y la presencia de huevos. Los grupos E/S y PM tuvieron menor carga parasitaria y ausencia de huevos en comparación al control, aunque no hubo diferencia estadística significativa. Los resultados muestran la posibilidad de continuar estudios con estos antígenos, ya que la inhibición del desarrollo embrionario es crucial para detener la transmisión a hospederos intermediarios y al hombre. -- Palabras clave: Echinococcus granulosus, protoescólex, inmunización, antígeno excretorio-secretorio, equinococosis quística.

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