Actividad antimicrobiana de péptidos parcialmente purificados de las fracciones proteícas de semillas de kañihua (Chenopodium pallidicaule Aellen) variedades Ramis y Cupi-sayhua

Abstract

Estudia el fraccionamiento proteico y caracterización electroforética de las proteínas de las semillas de kañihua variedades Ramis y Cupi-Sayhua, a través de la evaluación de cinco técnicas de fraccionamiento proteico según la solubilidad de Osborne considerando solventes, metodologías y tiempo de extracción, para obtener fracciones proteicas albuminas, globulinas 7S, globulinas 11S, prolaminas y glutelinas con mayores contenidos proteínicos y rendimientos porcentuales. Posteriormente, se utilizó la concentración 4% (p/v) de las fracciones proteicas de kañihua de ambas variedades, para hidrolizarlas con las enzimas Alcalasa, sistema secuencial Pepsina-pancreatina y Proteasa Ps, en las razones enzima/sustrato (E/S) 1:10, 1:30 y 1:50, se midió el grado de hidrólisis (GH) y la cinética de hidrólisis. A continuación, se determinó la inhibición del crecimiento microbiano de los hidrolizados sobre Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Candida albicans desde las 0 hasta 24 h mediante espectrofotometría. Luego, se seleccionaron los hidrolizados proteicos con mayor actividad antimicrobiana. Finalmente, se realizó la purificación parcial de los péptidos de estas fracciones por cromatografía de filtración en gel en dos matrices (Sephadex G-25 y G-10), y se volvió a evaluar la inhibición del crecimiento microbiano por espectrofotometría y por difusión en agar. Los resultados del fraccionamiento proteico de las semillas de kañihua variedades Ramis y Cupi-Sayhua, mostraron el mayor contenido proteico en la harina deslipidizada en comparación a la integral (P ≤ 0,05), el mayor rendimiento porcentual (P ≤ 0,05) durante 1 h de extracción secuencial de las fracciones proteicas, se obtuvo con la técnica de Rodríguez et al. (2011) para albuminas y glutelinas, y con la técnica de Barba de la Rosa et al. (2009) para globulinas y prolaminas. Se encontró en kañihua Ramis y Cupi-Sayhua las concentraciones en albuminas de 15,4 ± 0,3 y 15,8 ± 0,3%, globulinas 7S 24,1 ± 0,5 y 26,3 ± 1,0%, globulinas 11S 25,7 ± 1,0 y 26,7 ± 1,0%, prolaminas 9,6 ± 0,1 y 9,9 ± 0,5% y glutelinas 22,9 ± 0,1 y 21,5 ± 1,4%, respectivamente. El perfil electroforético mostró patrones similares en número de bandas y diferentes en concentración en ambas variedades de kañihua, siendo más intensas en kañihua Cupi-Sayhua. Los resultados de la cinética de hidrólisis con las tres enzimas mostró mayor GH en la razón (E/S) 1:10, las albuminas presentaron diferentes tiempos de hidrólisis inicial progresiva e hidrólisis constante, para Alcalasa (2 y 24 h), Pepsina-pancreatina (1 y 3 h) y Proteasa Ps (2 y 9 h). Sin embargo, en las globulinas 7S, globulinas 11S y glutelinas tuvieron similares tiempos de hidrólisis inicial progresiva e hidrólisis constante (0,5 y 9 h) para Alcalasa y Proteasa Ps, y diferentes (2 y 4 h) con Pepsina-pancreatina; los tiempos de hidrólisis con las tres proteasas presentaron diferencias (P ≤ 0,05). Además, se observó en la hidrólisis total (htotal) de las fracciones proteicas de kañihua en ambas variedades, valores de htotal entre 7,8 y 9,9%, similares a los reportados para trigo y soya. También, se obtuvo GH obtenidos con Alcalasa en albuminas que fueron variables entre 14 a 54, globulinas 7S entre 15 a 32, globulinas 11S entre 14 a 25, y glutelinas entre 12 y 30. Así mismo, los GH fueron variables con Pepsina-Pancreatina observándose en albuminas entre 22 a 67, globulinas 7S entre 7 a 29, globulinas 11S entre 17 a 31, y glutelinas entre 15 a 40. A diferencia, los GH fueron bajos con Proteasa Ps mostrándose en albuminas entre 4 a 8, globulinas 7S entre 5 a 12, globulina 11S entre 4 a 8, y glutelinas entre 4 a 15. En los resultados de inhibición del crecimiento microbiano, los hidrolizados de kañihua Ramis y Cupi-Sayhua que presentaron mayor inhibición significativa fueron los obtenidos con el sistema secuencial Pepsina-Pancreatina, seguido de los hidrolizados de Alcalasa y Proteasa Ps. Observándose mayor inhibición del crecimiento significativo sobre E. coli y S. aureus. Además, los hidrolizados proteicos de kañihua de ambas variedades que presentaron inhibición del crecimiento microbiano mayor a 45% en comparación al control (P ≤ 0,05), fueron los obtenidos por Alcalasa Glut KS 9 h (1:10) con 88,0% (GH 30%) y Glut KR 9 h (1:10) con 87,3% (GH 16%) sobre E. coli; Glob 7S KR 9 h (1:10) con 50,7% (GH 20%) contra S. aureus; Glob 11S KR 9 h (1:50) con 65% (GH 15%) sobre C. albicans. Los obtenidos por Pepsina-pancreatina Glut KS 4 h (1:10) con 88,7% (GH 40%) y Glut KR 4 h (1:10) con 87,7% (GH 37%) contra E. coli; Glob 11S KS 2 h (1:50) con 69,3% (GH 19%) sobre S. aureus y Glob 11S KR 2 h (1:10) con 68,3% (GH 23%) contra C. albicans. Los obtenidos por Proteasa Ps Alb KR 9 h (1:50) con 49,0% (GH 4%) sobre C. albicans. Finalmente, en la purificación parcial de los péptidos de kañihua se mostró incrementó significativo de la inhibición del crecimiento microbiano en comparación a los hidrolizados proteicos, tanto en la prueba espectrofotométrica como en difusión en agar, siendo el péptido Glut KS 4 h (1:10) el que presentó inhibición frente a E. coli y C. albicans por debajo de los controles gentamicina y nistatina. Además, este péptido obtenido con el sistema secuencial Pepsina-pancreatina mostró alta inhibición del crecimiento microbiano significativo (% Inh ≤ 95). Estos resultados, fueron corroborados con la prueba de difusión en agar, donde se observaron los halos de inhibición (P ≤ 0,05) en comparación a los controles.