Caracterización de células germinales testiculares de Vicugna pacos (alpaca) y expresión de biomarcadores específicos en tejido gonadal

Abstract

Aisla células germinales testiculares de Vicugna pacos, las caracteriza morfológicamente y detecta a nivel transcripcional la expresión de biomarcadores específicos para células madre espermatogoniales en tejido gonadal durante el desarrollo testicular posnatal. Los testículos fueron colectados en estancias alpaqueras de Ayacucho y Huancavelica (Aprox. 4,200 m.s.n.m.) y en el Matadero Municipal de Huancavelica (Aprox. 3,600 m.s.n.m.). La biometría testicular, el aislamiento de espermatogonias y la determinación de viabilidad y rendimiento, así como la citometría de flujo, se hicieron a partir de muestras frescas. Para la extracción de RNA por el método del fenol/cloroformo, los testículos fueron previamente obtenidos por castración del animal vivo, transportados en nitrógeno líquido a -196°C y almacenados en ultracongelación a -80°C.Se diseñaron primers con el Programa Oligo6, a partir de exones rescatados y RNA ensamblados para alpaca, tomando como base los exones codificantes de cada uno de los biomarcadores encontrados en el genoma de Bos taurus, los mismos que fueron sintetizados por Macrogen (Corea del Sur) y utilizados para amplificar el cDNA de alpaca. La viabilidad y el rendimiento fueron superiores enalpacas de 10-12 meses de edad, con valores de 92.15% y 55 x 106 espermatogonias/ml, respectivamente. Las espermatogonias de alpaca tuvieron un diámetro promedio de 16 , las células germinales de alpaca mostraron reactividad frente al conjugado del fluorocromo isotiocianato de fluoresceína con la aglutinina de Dolichos biflorus. A partir de siete biomarcadores positivos para SSC seleccionados (Zbtb16, GFR -1, Stra8, Nanos2, Ngn3, Lin28 y Ecad), tres negativos (Ckit, Sohlh1 y Sohlh2) y tres genes de referencia (Rplp0, Gadph y Actb), se lograron detectar Nanos2, Lin28, Ckit, RPLP0 y Actb en tejido testicular de alpaca. Se concluye que la edad más apropiada para aislar espermatogonias, caracterizarlas morfológicamente y detectar biomarcadores específicos de SSC en alpaca, es de 10-12 meses.