EP Genética y Biotecnología

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Aislamiento y enriquecimiento in vitro de células madre espermatogoniales de alpaca (Vicugna pacos) y caracterización de co-cultivos con células de Sertoli
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2021) Sulca Cervan, Catherine Claudia; Valdivia Cuya, Martha Esther
Establece un protocolo de enriquecimiento de las células madre espermatogoniales (SSC) mediante gradientes discontinuas de Percoll y desarrollar co-cultivos con células de Sertoli que permita el cultivo continuo de las SSC, sentando las bases para futuros trabajos que busquen contribuir con la conservación del material genético de especies con problemas de fertilidad. Veinte muestras testiculares de alpacas adultas provenientes del Camal Municipal de Huancavelica fueron seleccionadas según sus parámetros espermáticos. Las biopsias testiculares fueron sometidas a dos digestiones enzimáticas, cuya suspensión resultante fue denominada Grupo Control (GC), y la purificación de éstas mediante las gradientes discontinuas, Grupo Post Percoll (GPP). Las muestras fueron evaluadas mediante Citometría de Flujo (CF) y Microscopía de Fluorescencia (MF) empleando el conjugado DBA-FITC con el que se identificó a las SSC como el grupo celular con mayor intensidad de fluorescencia (sDBA+). La evaluación por CF de 8 muestras y el análisis por MF de las 12 muestras restantes mostraron una mayor media porcentual de la población de SSC en el GPP en comparación a la del GC, afirmando el enriquecimiento de las SSC mediante las gradientes de Percoll (p<0.05). Además, la comparación de la viabilidad celular entre ambos grupos (GC: 92.59 ± 6.92% y GPP: 92.47 ± 5.79%) no mostró diferencia significativa (p>0.05). Estas poblaciones celulares iniciales (GC y GPP) fueron cultivadas durante 8 días en medio DMEM, denominándose Grupo Cultivo Control (GCC) y Grupo Cultivo Post Percoll (GCP) y fueron evaluados por CF y MF, encontrándose un aumento de la población de SSC en los post-cultivos. El análisis por CF no mostró diferencia significativa entre los grupos iniciales y sus respectivos cultivos (GC: 37.02 ± 29.21% vs GCC: 44.80 ± 19.63% y GP: 62.46 ± 33.15% vs GCP: 53.16 ± 14.49%); por el contrario, la evaluación por MF sí mostró un incremento significativo de la población sDBA+ en los cultivos (GC: 13.33 ± 18.88% vs GCC: 50.36 ± 8.07% y GP: 30.85 ± 21.98% vs GCP: 60.46 ± 7.31%). Paralelamente, se aislaron las células de Sertoli del grupo de células testiculares empleando la lectina DSA y se cultivaron en medio DMEM + 10%SBF. Una vez alcanzado el 90% de confluencia, éstas se co-cultivaron con las SSC enriquecidas en medio DMEM. En los primeros tres días se observó un rápido crecimiento de las SSC en contacto con las células de Sertoli y la formación de quistes sincitiales de SSC luego de aproximadamente dos semanas, lo que no se observó en los cultivos de células madre espermatogoniales enriquecidas sin células de Sertoli. Del presente estudio se concluye que el empleo de las gradientes de Percoll es un buen método de enriquecimiento de SSC y el co-cultivo con células de Sertoli es capaz de promover la proliferación de las SSC en cultivos de corto plazo.
Efecto de la suplementación de L-cisteína en el dilutor Tes-Tris-Yema, sobre la calidad espermática post-descongelamiento en alpaca (Vicugna pacos)
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2014) Suárez Pinedo, Marilyn Reyna; Valdivia Cuya, Martha Esther
El estudio evaluó el efecto de la suplementación de L- cisteína al dilutor tes-tris-yema sobre la calidad post descongelación de espermatozoides de Vicugna pacos “alpaca”. Con este propósito, dieciséis muestras de espermatozoides epididimarios fueron colectados de alpacas en el Camal Municipal de Huancavelica - Perú, durante un período de cuatro semanas. Cada muestra se diluyó en el dilutor Tes-Tris-Yema de huevo y se dividió en cuatro alícuotas, conteniendo diferentes concentraciones del antioxidante: L-cisteína 0 mM (tratamiento control), L- cisteína 2.5 mM (tratamiento 1), L-cisteína 5 mM (tratamiento 2) y L-cisteína 10 mM (tratamiento 3). Luego las suspensiones espermáticas fueron cargadas en pajillas (0,25 mL) y criopreservadas mediante la metodología de congelamiento lento programado en un congelador de velocidad controlada, finalmente las pajillas se almacenaron en nitrógeno líquido. La descongelación se realizó a 50 ° C durante 7 seg, la movilidad, vitalidad, integridad de membrana plasmática y acrosómica de los espermatozoides; fueron evaluados post descongelación. Los resultados de este estudio mostraron que la suplementación de 2.5 mM de L- cisteína en el medio dilutor de criopreservación mejora significativamente la movilidad y la integridad de la membrana plasmática de los espermatozoides después de la descongelación, en comparación con los demás tratamientos y el grupo control (p < 0.05). Se concluye que la adición de L- cisteína a bajas concentraciones (2.5 mM) en el dilutor proporciona un efecto crioprotector sobre los parámetros espermáticos post descongelación en alpaca.
Efecto del α–tocoferol durante el proceso de criopreservación en espermatozoides de alpaca (Vicugna pacos)
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2013) Mancisidor Solorzano, Isela Betsy; Valdivia Cuya, Martha Esther
Espermatozoides criopreservados de Vicugna pacos “alpaca” fueron sometidos a condiciones estresantes que estarían asociadas con una sobreproducción de especies reactivas de oxigeno (ROS) y una disminución de su capacidad antioxidante lo que conlleva a la peroxidación lipídica de sus membranas reduciendo su viabilidad celular. El objetivo de este estudio fue investigar el efecto del suplemento α–Tocoferol en la movilidad, vitalidad, integridad funcional de membrana (HOST) e integridad acrosomal de espermatozoides de alpaca congelados/descongelados. Espermatozoides epididimarios obtenidos de 16 alpacas fueron criopreservados en medio TES-Tris-yema suplementado con distintas concentraciones de α–Tocoferol (0, 200, 500 y 1000 μg/mL usando el procedimiento de congelamiento lento en pajillas y almacenados a -196 ºC por un periodo mínimo de 30 días. Los resultados mostraron que los valores de motilidad espermática en los grupos suplementados fueron significativamente (p<0.05) mayores que el grupo no suplementado. El diluyente suplementado con 200 μg/mL de α–Tocoferol tuvo un valor de vitalidad significativamente más alto que con las otras concentraciones (p<0.05). Los porcentajes de HOST y acrosoma intacto fueron significativamente mejorados (p<0.05) por la suplementación con 200 μg/mL de α–Tocoferol comparado con el grupo control. En conclusión, α–Tocoferol, como suplemento, a una concentración de 200 μg/mL en el diluyente TES-Tris-yema durante la criopreservación tuvo un efecto positivo en la calidad espermática post-descongelamiento.
Fragmentación de ADN en espermatozoides epididimarios de Vicugna pacos “ALPACA” mediante el test de dispersión de la cromatina y su potencial impacto en el desarrollo embrionario temprano
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2022) Rodríguez Castillo, Emanuel; Valdivia Cuya, Martha Esther
El fenómeno de fragmentación de ADN espermático es aquella condición en la que el ADN de las células espermáticas, frente a condiciones metabólicamente anómalas propias o inducidas por el entorno, experimentan daño estructural a nivel de la cadena nucleotídica, condicionando la supervivencia celular a la extensión del daño recibido e influyendo en la salud y el bienestar de la descendencia al fecundar un ovocito. En la actualidad, muchos embriólogos avalan la importancia de fecundar con espermatozoides con baja fragmentación espermática y por lo tanto se han venido desarrollado diversas técnicas para cuantificarlo, dentro de ellas está el ensayo de dispersión de la cromatina espermática o prueba SCD. El objetivo de este estudio fue demostrar si el empleo de la prueba SCD sirve como predictor de calidad espermática en alpacas, a la vez poder medir su implicancia en los procesos de desarrollo embrionario temprano, para el primer objetivo se procesaron 45 pares de muestras epididimarias colectadas en el Camal Municipal de Huancavelica (aprox. 3600 msnm) siendo estas analizadas en los parámetros espermáticos convencionales y mediante la prueba SCD. Para medir la implicancia de la fragmentación en el desarrollo embrionario se llevó a cabo 4 fecundaciones in vitro usando 111 ovocitos MII previamente madurados en laboratorio, separándose en grupos de evaluación según el nivel de fragmentación de la muestra espermática (Grupo A <2% IFA, Grupo B 2-4% IFA y Grupo C 4-6% IFA) y monitorizando el desarrollo a través de la observación directa en tres etapas: fecundación, formación mórulas y de blastocistos. Se obtuvo un valor promedio de la fragmentación espermática de alpaca expresado como índice de fragmentación de ADN (IFA) de 20.98 ± 32.54%, así mismo se demostró estadísticamente que el IFA puede correlacionarse positivamente con el porcentaje de espermatozoides inmóviles y negativamente con la movilidad progresiva y concentración (p<0.05). La evaluación de los estadios embrionarios solo produjo resultados comparables en el Grupo A y Grupo C encontrándose que no había diferencias significativas entre ambos grupos durante la monitorización embrionaria (p>0.05). Se concluye que es posible usar el IFA como un predictor de calidad espermática, mas el nivel de IFA usado en este trabajo no es estadísticamente significativo para evidenciar su relación con alguno de los tres estadios de desarrollo embrionario preimplantacional analizados.
Proliferación de células madre espermatogoniales (SSC) de alpaca (Vicugna pacos) y su posterior criopreservación
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2018) Reyes Vasquez, Jhakelin Gloria; Valdivia Cuya, Martha Esther
Compara el porcentaje y calidad postdescongelamiento de células madre espermatogoniales (SSC) de alpaca proliferadas y no proliferadas in vitro. Para ello se emplearon biopsias testiculares de 22 animales provenientes del camal municipal de Huancavelica (aproximadamente 22 horas post mortem). Los parámetros espermáticos iniciales (movilidad y concentración) fueron evaluados en cada muestra a partir de espermatozoides epididimarios. Se obtuvieron suspensiones de células testiculares mediante digestiones enzimáticas y se evaluó la concentración y vitalidad de las células, luego, las células testiculares fueron cultivadas in vitro (FP), criopreservadas mediante un protocolo termocontrolado lento, descongeladas y proliferadas (CP), o proliferadas y luego criopreservadas (PC). La evaluación de las células fue realizada mediante citometría de flujo con marcadores específicos para SSC (DBA-FITC) y Flow Cellect mitopotential Red Kit para la calidad celular (Potencial mitocondrial activo y apoptosis). El porcentaje de SSC en las muestras PC fue de 6.3% ± 1.2, el cual fue mayor que el porcentaje de SSC en las muestras CP, que fue de solo 1.5% ± 0.3 (p< 0.05). La calidad de las SSC fue mejor preservada en las PC, que mostró un 72.6% de células con potencial mitocondrial activo (PMA), 7.8 % de células apoptóticas (A) y 8.1% de células en apoptosis temprana (EA), mientras que en las CP el porcentaje de PMA fue de 59.7%, y valores de 21.3% de apoptosis y 11.5 de apoptosis temprana, que difieren significativamente de las PC y las FP. Se concluye que el cultivo de células testiculares de alpaca previo a la criopreservación permite conservar un mayor porcentaje (6,3%± 1.2) de SSC que la criopreservación sin cultivo previo (1.5% ± 0.3); asimismo conserva la calidad de las SSC a diferencia de las células criopreservadas sin cultivo. De esta forma, el presente trabajo constituye un primer reporte en el cual las técnicas de cultivo celular y criopreservación permiten el mantenimiento del porcentaje y la calidad de las SSC de alpaca.
Proliferación de células madre espermatogoniales de alpaca (Vicugna pacos) en presencia de matrices extracelulares
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2020) Suarez Poccorpachi, Maria del Pilar; Valdivia Cuya, Martha Esther
La importancia de las células madre espermatogoniales (SSC) radica en su capacidad de autorenovación y diferenciación, dando lugar a la espermatogénesis, es por esto que se busca la proliferación In vitro de este tipo de células ya que representan un pequeño porcentaje de la población celular en testículos de machos adultos y poderlas emplear en la preservación de especies. Debido a la problemática reproductiva que presenta la alpaca en sus condiciones naturales, el empleo de SSC de alpaca surge como una alternativa para conservar la genética de individuos de esta especie. En este contexto, el objetivo de este trabajo de investigación fue cultivar células madre espermatogoniales de alpaca en presencia de moléculas como la gelatina y DBA y evaluar cuál de los distintos métodos provee un mayor soporte para la proliferación de las SSC. Se procesaron 12 pares de testículos de alpaca que fueron colectados en el Camal Municipal de Huancavelica (Aprox. 3,600 msnm), seleccionadas según la evaluación de sus parámetros espermáticos (concentración, viabilidad y movilidad espermática). Las suspensiones celulares obtenidas luego del aislamiento fueron purificadas por gradientes de Percoll y se evaluó la población de SSC por medio del marcaje con DBAFITC por Microscopía de Fluorescencia (MF) y Citometría de Flujo (CF), obteniéndose un porcentaje de células madre espermatogoniales post Percoll de 49.68 ± 10.9% y 83.72 ± 8.5% por MF y CF, respectivamente los cuales fueron mucho mayor a sus respectivos iniciales de 22 ± 5.45% (MF) y 46.52 ± 17.84% (CF), siendo esta diferencia estadísticamente significativa por ambas metodologías (p<0.05). Con respecto a la viabilidad celular no se ve afectada por el empleo del Percoll (p>0.05), siendo 94.89 ± 6.73% y 91.33 ± 6.58% antes y después del Percoll, respectivamente. Las células obtenidas antes y después de la purificación fueron cultivadas en placas normales (Grupo control y Grupo Percoll, respectivamente) y en placas cubiertas con gelatina y DBA (Grupo gelatina y Grupo DBA, respectivamente). Durante el monitoreo de los cultivos, la viabilidad celular entre grupos de tratamiento no se vio afectada significativamente (p>0.05), sin embargo, se observó disminución en la viabilidad entre días de cultivo siendo significativamente diferente entre el día 0 y 3 del cultivo para todos los grupos de tratamiento. Además, se observó la formación de colonias de SSC en todos los grupos al día 3 de cultivo, excepto en el Grupo control, donde la formación de estas fue mínima. Sin embargo, estas colonias empezaron a desaparecer al sexto día de cultivo. Luego de 8 días de cultivo se evaluó el porcentaje de SSC entre los distintos tratamientos por MF y CF, obteniéndose un mayor porcentaje de SSC en el Grupo DBA (63.28 ± 5.61% y 66.9 ± 10.34%) y el menor para el Grupo Control (44.48 ± 6.34% y 52.60 ± 23.44%), siendo los porcentajes intermedios para el Grupo Percoll (52.38 ± 5.64% y 57.95 ± 20.2%) y Gelatina (46.36 ± 4.14% y 53.05 ± 17.73%). Siendo el primer porcentaje obtenido por MF y el segundo por CF, se encontró que el Grupo DBA muestra diferencia significativa con respecto a los demás tratamientos por Microscopía de Fluorescencia (p<0.05), sin embargo, por Citometría de Flujo no se encontró diferencia significativa entre tratamientos (p>0.05). Se concluye que el empleo de gradientes de Percoll es un buen método para la purificación de SSC y que el empleo de la lectina DBA puede soportar la proliferación In vitro de SSC de alpaca.

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