EP Genética y Biotecnología

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Aislamiento, caracterización y análisis del ADN codificante de la glicoproteína de zona pelúcida de tipo 2 (aZP2) de alpaca (Lama pacos)
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2009) Pérez Gamarra, Susan Karen; Valdivia Cuya, Martha Esther
La Zona Pelúcida es la matriz extracelular que rodea a los ovocitos de vertebrados, cumple roles trascendentales en la reproducción, incluyendo el reconocimiento y unión de gametos especie-específico, inducción de la reacción acrosómica (RA) del espermatozoide, el bloqueo de la poliespermia, mantiene la integridad del embrión temprano durante su transición por el oviducto; está constituida por tres glicoproteínas: ZP3 que induce RA; ZP1, estructural, que interconecta a ZP3 y ZP2. ZP2 es la molécula de unión secundaria, interactúa con los receptores espermáticos expuestos después de RA siendo necesaria para mantener la unión del espermatozoide al ovocito, su modificación proteolítica después de la fertilización permite el bloqueo de la poliespermia. ZP2 participa también en la organización, el desarrollo y maduración del ovocito, puesto que mantiene consistente la matriz y la interacción entre las células periféricas y la célula germinal. Se caracterizó y analizó in silico la secuencia codificante parcial de la glicoproteína de Zona Pelúcida tipo 2 (aZP2) en alpacas, se determinó que esta proteína se expresa exclusivamente en los ovarios. Además está secuencia parcial analizada se encuentra conservada, constituyéndose un grupo monofilético entre los Cetarteodactyla. La presente Tesis aporta conocimiento básico sobre la glicoproteína aZP2 en alpacas, proteína implícita en la fecundación, conocerla implícitamente beneficia el mejoramiento de las actuales técnicas biotecnológicas reproductivas tales como la maduración folicular-ovocitaria, criopreservación de gametos y embriones, fertilización in vitro e inyección intracitoplasmática del espermatozoide, técnicas que se intentan aplicar con muchas dificultades en camélidos.
Ayudando a descifrar el enigma taxonómico, el código de barras de ADN de Megalobulimus spp. (Mollusca, Gastropoda) del departamento de San Martín - Perú
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2010) Congrains Castillo, Carlos; Ramírez Mesías, Rina Lastenia
Dentro de la gama de especies de la selva peruana, se encuentran caracoles terrestres de la familia Megalobulimidae (Mollusca, Gastropoda), entre las que destacan Megalobulimus popelairianus, Megalobulimus huascari y Megalobulimus capillaceus, que tienen importancia económica por las propiedades nutricionales de su carne y cosméticas de su baba. Este trabajo tuvo por objetivo principal desarrollar perfiles de ADN de los Megalobulimidae de San Martín, que hagan posible su reconocimiento a nivel específico y estudiar su salud genético poblacional mediante la diversidad genética, todo ello para garantizar su uso sustentable y eventualmente certificar a estas especies en el biocomercio peruano. Se evaluaron 65 muestras biológicas que fueron colectadas en septiembre de 2007 y enero, febrero y marzo de 2008. Se realizó la extracción de ADN con el método del CTAB y cloroformo, alcohol-isoamílico a partir de tejido muscular de pie. Se amplificaron y secuenciaron regiones de los genes rRNA y Citrocromo C oxidasa subunidad I (COI) del genoma mitocondrial con primers internos y universales, respectivamente. Las secuencias de ADN fueron alineadas, caracterizadas, se determinó la calidad de los datos, distancias genéticas, diversidad genética, se realizó la reconstrucción filogenética con NJ, MP, ML e BI y se analizaron los perfiles de ADN. La tasa de éxito de amplificación del COI fue inferior a la del rRNA. Sorprendentemente, las 31 secuencias de ADN de M. capillaceus no mostraron ninguna variante genética. Los ejemplares de difícil identificación entre M. huascari y M. popelairianus (rotulados como Megalobulimus spp.) mostraron bajos valores de divergencia genética (menores al 2%) con M. huascari, además que formaron grupos monofiléticos estadísticamente bien sustentados con el gen COI con todos los métodos utilizados. Las filogenias con el rRNA fueron poco concluyentes y variaron según las metodologías. Los datos combinados de ambos genes arrojaron árboles filogenéticos no resueltos. La carencia de diversidad genética de M. capillaceus, que muy probablemente haya sido producida por la sobreexplotación, pone en riesgo su supervivencia como especie.
Caracterización molecular de Andiniastra violascens: código de barra de ADN, diversidad genética y relaciones filogenéticas dentro de la familia Clausiliidae (Gastropoda) de distribución mundial
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2018) Morín Lagos, Jaime Gerardo; Ramírez Mesías, Rina Lastenia
Realiza la caracterización molecular de Andiniastra violascens (Amazonas) y se obtuvo su posición filogenética dentro de la subfamilia Peruiniinae. Además, se aprovechó el material disponible en la colección científica de Malacología del Museo de Historia Natural de la UNMSM para caracterizar y evaluar molecularmente a los Clausiliidae peruanos del género Cylindronenia (Amazonas) y Symptychiella (San Martín) y a una población de Andiniastra sp. colectada en Cajamarca. Se estandarizaron los protocolos moleculares necesarios para obtener secuencias del marcador nuclear 28S rRNA. De esta manera, se obtuvieron por primera vez secuencias de Andiniastra y Symptychiella, aumentando así la cobertura de géneros de Peruiniinae a 40.7% de los 27 géneros descritos para ese grupo. El análisis de estas secuencias de ADN evidenció que el género Andiniastra es monofilético y comparte un ancestro común con el clado conformado por Andinia (género al que A. violascens fue asignada inicialmente), Steeriana y Cylindronenia, mientras que Symptychiella estaría formando un clado muy bien soportado con Zilchiella. Además, se generaron secuencias mitocondriales de COI (28 secuencias) y 16S rRNA (31 secuencias), las cuales representan las primeras en su tipo para Peruiniinae, que se utilizaron para evaluar la variación intraespecífica y la utilidad de ellas como código de barras. Finalmente, las diferencias morfológicas encontradas en el análisis inicial, la divergencia genética en base a los marcadores COI, 16S rRNA y 28S rRNA, los cambios hallados en las secuencias aminoacídicas deducidas de COI y los análisis de estructuras secundarias de 16S rRNA sugieren que Andiniastra sp. podría ser en realidad un nuevo taxón. Adicionalmente, se realizó una calibración secundaria del árbol ML y se encontró que A. violascens (Amazonas) y Andiniastra sp. (Cajamarca) divergieron hace aproximadamente 12.3 millones de años lo que concuerda con el periodo de levantamiento acelerado de los Andes (entre 10 y 5 Ma), evento que pudo haber influenciado en la especiación de este género.
Caracterización y análisis bioinformático de genes regulados hacia arriba en el transcriptoma de plantas de Solanum acaule expuestas a heladas y su comparación con el transcriptoma de Solanum tuberosum
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2016) Anconeyra Barrios, César; Neira Gonzáles, Miguel Ángel; De Stefano Beltrán, Luis Julio César
Determina la diversidad de los genes asociados a la tolerancia a heladas con aclimatación al frío en Solanum acaule. Para esto, se analizan 680 clones mediante distintos métodos bioinformáticos para conocer la predicción de sus características y funciones. Como resultado, se ha encontrado diez genes de interés potencial vinculados con la tolerancia a las heladas en S. acaule que, en experimentos posteriores, serán sometidos a otras pruebas para conocer sus funciones in vivo. Las heladas son el mayor factor limitante en la productividad de los cultivos ya que restringen la distribución de especies cultivables. En el Perú, el riesgo de daño severo por las heladas es uno de los factores predominantes de la producción de papa. No obstante, la gran variedad de papas que existe en nuestro país constituye una reserva de diversidad genética en donde se encuentran muchas características de interés económico aún no estudiadas. Dichas características nos permiten desarrollar nuevas variedades de papas resistentes al frio, sequía, entre otros factores limitantes.
Clonamiento y expresión de la proteína recombinante homóloga a catepsina l del metacéstodo de Taenia solium
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2012) León Janampa, Nancy; Talledo Rivera, Miguel Ángel Francisco; Sheen Cortavarría, Patricia
Taenia solium es un céstodo de vida parásita, cosmopolita y tiene como hospedero definitivo al hombre. Estos helmintos aplanados son los responsables de infestaciones frecuentes en zonas endémicas en América Latina, Asia y África, así como en naciones desarrolladas con flujo masivo de inmigrantes provenientes de áreas endémicas. La teniosis se produce cuando el hombre consume las larvas (cisticercos) de Taenia solium, mientras que la cisticercosis es causada por el consumo de los huevos. Estos últimos se desarrollan hasta cisticerco en diferentes tejidos, principalmente en el sistema nervioso central, causando la neurocisticercosis, la que se caracteriza por lesiones y diferencias en la respuesta inmunológica del huésped frente al parásito. Las manifestaciones clínicas más frecuentes son epilepsia, signos neurológicos de focalización, hipertensión endocraneal y deterioro cognitivo. En estudios realizados a partir de fluido de cisticerco se reportaron proteínas antigénicas importantes como la cisteín proteasa homóloga a catepsina L, la cual interviene en la invasividad del cisticerco, desde el tracto digestivo del hospedero hasta el músculo y sistema nervioso, a través del torrente sanguíneo. En el presente trabajo, se ha identificado el gen de una proteína similar a catepsina L de cisticerco a partir del genoma de T. solium, secuenciado en el laboratorio de Bioinformática y Biología Molecular (UPCH). La región codificante madura de la secuencia homóloga a Catepsina L fue de 633 nt, esta secuencia fue clonada y expresada en el vector pET28a; la proteína expresada de 22.3 kDa se encontró en el sedimento del lisado celular de Escherichia coli BL21 (DE3), sistema procariótico de expresión, lo cual indica que fue insoluble. Con el propósito de obtener la proteína soluble, se estandarizó la temperatura de crecimiento bacteriano, el tiempo de inducción y la concentración de IPTG, pero no fue posible lograrlo, posiblemente por las glicosilaciones postraduccionales que presenta esta proteína, y que que las bacterias no pueden realizar.
Clonamiento y expresión en sistema procariótico del dominio extracelular de la proteína de ensamblaje de lipopolisacáridos – D (LptD) de Bartonella bacilliformis
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2019) Flores Nuñez, Astrid Carolina; Sandoval Peña, Gustavo Adolfo
Evalúa in silico y serológicamente el potencial antigénico del dominio extracelular recombinante de la proteína de ensamblaje de lipopolisacáridos - D (LptD) de Bartonella bacilliformis. Por medio del análisis in silico se escogió a la proteína LptD por estar localizado en la membrana externa, poseer una alta probabilidad de ser antigénica, no presentar similitud con proteínas humanas, de ratón o de cerdo, ser una proteína de mediano peso molecular (86.80 kDa), presentar epítopes con alta afinidad a HLA clase I y II, los cuales, presentaron un alto índice de cobertura poblacional (Perú 100%, Sudamérica 93.8% y a nivel Mundial 99.28%). Mediante el uso de la tecnología de ADN recombinante se clonó en Escherichia coli TOP10 el gen del dominio extracelular de LptD fusionada a una cola de seis histidinas y se expresó en E. coli BL21 (DE3) pLysS. Las condiciones para inducción de la proteína recombinante fueron 0.5 mM IPTG, 16 horas, medio TB etanol al 3% (v/v), 28 0C, OD600: 1-1.5 y 200 r.p.m. La purificación se realizó en condiciones denaturantes con resina Ni-IDA (His60 Ni Superflow) a pequeña escala y se obtuvo 2.6 μg de LptD recombinante parcialmente purificada por cada 1 mL de cultivo bacteriano inducido (OD600: 1 - 1.5). El resultado positivo del ensayo de Western Blot permitió evidenciar la antigenicidad de la proteína LptD recombinante ante sueros de pacientes que sufrieron la enfermedad de Carrión. En conclusión, la proteína LptD recombinante muestra antigenicidad tanto in silico y serológicamente, estos resultados son base para posteriores estudios de la proteína LptD en la línea de investigación de candidatos vacunales contra la enfermedad de Carrión.
Diversidad genética y estructura poblacional de Megalobulimus huascari (Gastropoda: megalobulimidae), especie promisoria del biocomercio nacional
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2012) Chirinos Saire, Jenny Martha; Ramírez Mesías, Rina Lastenia
El estudio de Megalobulimus huascari abarcó diversos distritos de la provincia de Chanchamayo en el departamento de Junín, así como la provincia de Oxapampa en Pasco. Obtiene el perfil genético de M. huascari en base al marcador mitocondrial 16S rRNA, a fin de permitir su certificación molecular en el biocomercio y generar pautas para su conservación. Un segmento del genoma mitocondrial correspondiente al gen ribosomal 16S fue empleado como marcador molecular para realizar análisis filogeográficos y filogenéticos en la especie M. huascari. Se colectó muestras de 29 individuos distribuidos en siete poblaciones de los departamentos de Junín y Pasco en la Selva Central del Perú. Un total de diez haplotipos fueron hallados. Asimismo se pudo detectar niveles relativamente altos de diversidad haplotípica y niveles bajos de diversidad nucleotídica. Dos linajes distintos, A y B, fueron revelados mediante los análisis filogenéticos. La red de haplotipos (network) y el estadístico poblacional Fst indicaron ausencia de estructuración geográfica. Sin embargo, la repartición de la varianza molecular estuvo mejor explicada al hacer la agrupación a priori para los dos linajes observados en la filogenia de M. huascari. Los análisis de mismatch distribution y tests de neutralidad (Fu’Fs y Tajima) indicaron eventos de expansión poblacional para ambos linajes. La estructuración genética y distribución geográfica encontrada en las poblaciones de M. huascari puede ser atribuida a eventos tales como la orogenia de los Andes. Finalmente, el perfil 16S rRNA obtenido para M. huascari resultó ser una herramienta eficaz para la identificación de la especie a nivel molecular, lo cual permitirá optimizar las medidas relacionadas a su conservación y certificar a la especie dentro del comercio nacional.
Evaluación de los niveles de DNA circulante en plasma de pacientes con cáncer de mama por PCR digital
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2017) Murillo Carrasco, Alexis Germán; Velásquez Reinoso, Margarita Rosa Eugenia; Buleje Sono, José Luis
Evalúa los niveles de cfDNA en plasma mediante PCR digital en pacientes con cáncer de mama para implementar una técnica de diagnóstico temprano. Estandariza el método para obtener cfDNA en plasma. Evalúa los niveles de cfDNA en plasma por PCR digital a través de los genes PUM1 y RNasa P. Establece los niveles de cfDNA en plasma en pacientes con cáncer de mama e individuos sanos. Relaciona los niveles de cfDNA en plasma con el estadio neoplásico. Es una investigación descriptiva, prospectiva, cuantitativa, transversal, observacional y de caso-control. Utiliza una muestra de 16 mujeres con edades entre 28-80 años diagnosticadas con cáncer de mama y otra de 21 mujeres sin diagnóstico positivo para cáncer de mama, mayores de 40 años, las cuales son codificadas como grupo control. Encuentra que el cfDNA es un biomarcador apropiado como herramienta diagnóstica en cáncer de mama, la extracción de cfDNA con perlas magnéticas es un método idóneo que asegura la mayor concentración y pureza de la muestra y que la PCR digital está calificada para la cuantificación absoluta de cfDNA en muestras de pacientes y controles. Señala la existencia de diferencias significativas entre niveles de cfDNA de pacientes con cáncer de mama y controles.
Evolución del complejo de especies Bostryx modestus basado en el gen de la Citocromo C oxidase subunidad I del genoma mitocondrial
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2009) Chumbe Mendoza, Ana Luz; Ramírez Mesías, Rina Lastenia
El desierto costero del Perú alberga diversidad de especies de moluscos terrestres, los que conservan en su genoma toda una historia de cambios ambientales. Al evaluar genéticamente especies de distribución restringida en este tipo de escenarios se podría inferir su desarrollo histórico. Bostryx es uno de los géneros más ampliamente distribuidos en el occidente peruano; tres especies de este género conforman el llamado complejo de especies Bostryx modestus, que incluye a Bostryx modestus, Bostryx sordidus y Bostryx scalariformis, principalmente distribuidos en el ecosistema de Lomas. Con la finalidad de dilucidar las relaciones evolutivas de este complejo y asignar posibles perfiles COI a las mencionadas especies, se usó el marcador mitocondrial Citocromo Oxidasa subunidad I (COI), marcador estrella en el desarrollo del código de barras de la vida. Se usaron 21 ejemplares de B. modestus, B. sordidus y B. scalariformis, de diferentes zonas de Lima, además de ejemplares de B. conspersus, B. turritus y Scutalus spp. como grupo externo. Se obtuvo DNA total de tejido muscular del pie (2 mm3 ) de dichos individuos. Posterior a estandarizar la amplificación de COI en estas especies endémicas de la costa peruana, se procedió a la amplificación y secuenciamiento de las mismas. Las 29 secuencias obtenidas colapsaron en 19 haplotipos, uno de los cuales fue compartido por tres individuos de Bostryx sordidus y un Bostryx modestus (srStmd). Los demás haplotipos fueron únicos por especie, incluyendo un haplotipo muy divergente de Bostryx modestus de las Lomas de Picapiedra (mdPiL). La hipótesis evolutiva estimada por cuatro metodologías distintas: Neighbor-joining (NJ), Máxima Parsimonia (MP), Máxima verosimilitud (Maximum Likelihood, ML) e Inferencia Bayesiana (IB), mostró una topología similar en todos los casos con 13 de los 14 ejemplares de B. modestus, B. sordidus y B. scalariformis formando un grupo monofilético; dentro de este clado no se encontraron grupos monofiléticos por especie, impidiendo la obtención de perfiles COI. El tiempo de divergencia estimado para las especies B. modestus, B. sordidus y B. scalariformis resultó en el Pleistoceno (1.382 millones de años), época de grandes ciclos glaciales e interglaciales. La diversidad genética actual del grupo genera una topología de “árbol en estrella”, marca indiscutible de un modelo demográfico de cuello de botella genético seguido de súbita expansión demográfica, demostrando que el desierto peruano ha pasado por periodos de exuberancia producidos probablemente por paleo eventos El Niño/Oscilación Sur. El marcador COI no consiguió definir los límites de las especies B. modestus, B. sordidus y B. scalariformis, generando un árbol polifilético debido a diversificación reciente más que a la carencia de sensibilidad de este marcador. La costa peruana se muestra como un ambiente generador de diversidad biológica que merece ser preservado, para conservar la salud del ecosistema.
Fragmentación de ADN en espermatozoides epididimarios de Vicugna pacos “ALPACA” mediante el test de dispersión de la cromatina y su potencial impacto en el desarrollo embrionario temprano
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2022) Rodríguez Castillo, Emanuel; Valdivia Cuya, Martha Esther
El fenómeno de fragmentación de ADN espermático es aquella condición en la que el ADN de las células espermáticas, frente a condiciones metabólicamente anómalas propias o inducidas por el entorno, experimentan daño estructural a nivel de la cadena nucleotídica, condicionando la supervivencia celular a la extensión del daño recibido e influyendo en la salud y el bienestar de la descendencia al fecundar un ovocito. En la actualidad, muchos embriólogos avalan la importancia de fecundar con espermatozoides con baja fragmentación espermática y por lo tanto se han venido desarrollado diversas técnicas para cuantificarlo, dentro de ellas está el ensayo de dispersión de la cromatina espermática o prueba SCD. El objetivo de este estudio fue demostrar si el empleo de la prueba SCD sirve como predictor de calidad espermática en alpacas, a la vez poder medir su implicancia en los procesos de desarrollo embrionario temprano, para el primer objetivo se procesaron 45 pares de muestras epididimarias colectadas en el Camal Municipal de Huancavelica (aprox. 3600 msnm) siendo estas analizadas en los parámetros espermáticos convencionales y mediante la prueba SCD. Para medir la implicancia de la fragmentación en el desarrollo embrionario se llevó a cabo 4 fecundaciones in vitro usando 111 ovocitos MII previamente madurados en laboratorio, separándose en grupos de evaluación según el nivel de fragmentación de la muestra espermática (Grupo A <2% IFA, Grupo B 2-4% IFA y Grupo C 4-6% IFA) y monitorizando el desarrollo a través de la observación directa en tres etapas: fecundación, formación mórulas y de blastocistos. Se obtuvo un valor promedio de la fragmentación espermática de alpaca expresado como índice de fragmentación de ADN (IFA) de 20.98 ± 32.54%, así mismo se demostró estadísticamente que el IFA puede correlacionarse positivamente con el porcentaje de espermatozoides inmóviles y negativamente con la movilidad progresiva y concentración (p<0.05). La evaluación de los estadios embrionarios solo produjo resultados comparables en el Grupo A y Grupo C encontrándose que no había diferencias significativas entre ambos grupos durante la monitorización embrionaria (p>0.05). Se concluye que es posible usar el IFA como un predictor de calidad espermática, mas el nivel de IFA usado en este trabajo no es estadísticamente significativo para evidenciar su relación con alguno de los tres estadios de desarrollo embrionario preimplantacional analizados.

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