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Expresión de las interleucinas 2 y 10 de linfocitos de alpacas (Vicugna pacos) en presencia de antígenos clostridiales in vitro
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2013) Watanabe Watanabe, Raquel Andrea; Manchego Sayán, Alberto Gustavo
Determina mediante la técnica de RT-PCR tiempo real y cuantificación relativa según el método 2 -ΔΔCt, los niveles relativos de expresión de ARNm de IL-2 e IL-10 en leucocitos circulantes de alpacas en presencia de antígenos clostridiales in vitro, empleándose como control endógeno a GAPDH. Se colectó sangre entera usando la técnica de venopunción de la vena yugular de 5 alpacas hembras y 5 alpacas machos adultos. Las muestras fueron centrifugadas para obtener la fracción leucocitaria en gradiente de Ficoll, colectándose la capa flogística. Se realizó un pool de leucocitos que fueron purificados con cloruro de amonio y luego centrifugados, cuya concentración de células vivas se ajustó a 500 000 células/ml de medio mínimo esencial. Seguidamente, fueron cultivados en placas para cultivo celular de 24 pocillos y enfrentados a suspensiones de Clostridium perfringens a las concentraciones de 400ug/ml, 16ug/ml, 0.8ug/ml y 0.2ug/ml por 1, 12 y 24 horas. Posteriormente, se realizó la RT-qPCR. La cinética de la expresión de IL-2 mostró una tendencia inversamente proporcional a la dosis de antígeno clostridial en los tres tiempos de incubación (p>0.05), a diferencia de IL-10 cuya expresión fue variable, alcanzando el máximo a las 12 horas de incubación (p<0.05) mostrando un patrón similar al de IL-2. La expresión de IL-10 superó hasta en 40 veces lo expresado por el calibrador respecto a IL-2, evidenciándose una marcada respuesta hacia la polarización del subtipo Th2.
Respuesta inmune celular en la mucosa intestinal de crías de alpacas (Vicugna pacos) clínicamente sanas
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2016) Watanabe Watanabe, Raquel Andrea; Manchego Sayán, Alberto Gustavo
Evalúa cuantitativamente la expresión de los ARN mensajeros (ARNm) de los factores de transcripción T-bet, STAT-1 y STAT-4 y de las citoquinas interleucina (IL) 12, IL-2, interferón gamma (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) involucrados en la activación y desarrollo de los linfocitos Th1 de la mucosa intestinal de crías de alpacas (Vicugna pacos) de tres grupos de 1-8, 10-21 y 22-47 días de edad, alimentadas en rebaños con pasto natural en la sierra sur del Perú. Obtiene muestras de una longitud de 2 cm de la porción media del yeyuno de crías de alpacas clínicamente sanas de la Estación IVITA Maranganí (Cusco, Perú), las que fueron almacenadas a -196°C y procesadas en el Laboratorio de Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima, Perú). Extrae los ARN totales y desarrolla la PCR tiempo real con transcripción inversa (RT-PCR). Mide los valores de Ct (ciclo umbral, cycle treshold) y Tm (temperatura de disociación, temperatura de melting) de los productos del RT-PCR y emplea la técnica de cuantificación relativa 2-ΔΔCt a fin de evaluar la expresión de los ARNm de los factores mencionados respecto al control calibrador (fetos) en los tres grupos etáreos, empleándose como gen constitutivo de referencia a GAPDH. Las expresiones de T-bet, STAT-1 y STAT-4 muestran una tendencia positiva proporcional a la edad, siendo de 35, 6 y 3 veces lo expresado por el calibrador el grupo de 22-47 días de edad, respectivamente. Asimismo, las cinéticas de expresión en IL-2, IFN-γ y TNF-α muestran una tendencia positiva proporcional a la edad siendo de 26, más de cien y 5 veces lo expresado por el calibrador en el grupo de animales de 22-47 días de edad, respectivamente (p0.05). Concluye que la expresión de T-bet y STAT-1, factores transcripcionales activados por interferón gamma, se incrementa con la edad, así como también de las citoquinas involucradas en la respuesta inmune Th1, a diferencia de la expresión de STAT-4 e IL-12 que estadísticamente no difiere significativamente en los tres grupos etarios.