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Análisis genómico del virus de Influenza A aviar y porcino circulantes en Perú para el desarrollo de proteínas candidatas vacunales
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2024) Castro Sanguinetti, Gina Ruth; Nagardas Vakharia, Vikram
El virus de influenza A es el patógeno aviar más importante y representa gran preocupación para la salud pública y animal. Las aves acuáticas constituyen el reservorio natural de todos los subtipos y son fuente importante de transmisión a especies susceptibles como los cerdos. El Perú tiene una ubicación crucial en la ruta migratoria de aves silvestres en América y, por lo tanto, es relevante para la evolución viral. Debido a la importancia de la vigilancia de influenza aviar, el presente estudio tuvo como objetivo el aislamiento del virus en muestras fecales de aves acuáticas de la costa de Lima y muestras nasofaríngeas de cerdos en Perú en el periodo 2019-2021. Un total de 421 muestras aviares y 206 muestras porcinas se procesaron para aislamiento viral en huevos embrionados y cultivos celulares, respectivamente. La identificación viral se realizó mediante RT-PCR y análisis del genoma completo mediante NGS. Se detectaron cuatro subtipos del virus de influenza aviar de baja patogenicidad H2N6, H6N2, H6N8 y H13N6. El análisis filogenético reveló una alta relación con los virus de influenza aviar norteamericanos, destacando características distintivas que podrían conferirles propiedades únicas. Para la producción de proteínas recombinantes HAs se seleccionaron un virus de influenza aviar H2N6 obtenido en este estudio (rHA-H2), y un virus de influenza porcina H1N1 estrechamente relacionado con la cepa pdm2009 (rHA-H1), empleando un sistema vector de expresión de baculovirus. Se evaluó su capacidad funcional a través de la activación de la respuesta inmunitaria utilizando un modelo de inoculación intraabdominal/intraperitoneal en pollos y lechones. Se detectó una gran infiltración leucocitaria a las 24 horas postinoculación compuesta por polimorfonucleares, monocitos/macrófagos y linfocitos. Además, se identificaron patrones diferenciales de activación de macrófagos, como la producción de especies reactivas de oxígeno en ambos modelos animales. Para esto se utilizó una metodología combinatoria en base a características morfométricas y citometría de flujo. Los resultados mostraron que las proteínas rHA-H2 y rHA-H1 poseen una capacidad inmunogénica. Estos resultados establecen los fundamentos sobre el desarrollo inmunológico frente a estas proteínas recombinantes, como base para el establecimiento de una potencial respuesta inmune a largo plazo en estos modelos animales.
Caracterización molecular y filogenética de cepas emergentes del virus de la diarrea epidémica porcina detectadas en el Perú
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2016) Castro Sanguinetti, Gina Ruth; Ramírez Velásquez, Mercy Gisela
Caracteriza molecularmente y filogenéticamente las cepas emergentes del PEDV (Virus de la Diarrea Epidémica Porcina) en nuestro país obtenidas de lechones de 1 a 3 semanas de edad en los años 2013 y 2014, mediante el secuenciamiento del dominio S1 del gen S, teniendo como hipótesis que los brotes ocurridos tienen como origen a las cepas norteamericanas debido a la estrecha relación comercial porcina existente entre Perú y Estados Unidos.
Estandarización de la técnica RT-PCR a tiempo real para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss)
(Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2010) Castro Sanguinetti, Gina Ruth
El presente trabajo tuvo como objetivo estandarizar y validar la técnica de RT-PCR en tiempo real para el diagnóstico del virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (IPNV) en la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) en el Perú. Se utilizaron muestras de riñón y bazo de truchas arcoíris provenientes de dos piscigranjas del departamento de Junín, tomándose 61 animales con signos clínicos de enfermedad y 60 animales aparentemente sanos. Todas las muestras fueron evaluadas mediante la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) para determinar la presencia del virus. La prueba de RT-PCR tiempo real se realizó utilizando un kit comercial en dos pasos y utilizando el fluoróforo Sybr Green I. Se utilizaron los primers WB1 y WB2 para identificar un segmento genómico específico de la proteína estructural VP2. Como controles positivos se utilizaron virus inactivado IPNV cepa Sp, así como 10 muestras inoculadas con IPNV; y como controles negativos, se utilizaron virus relacionados a IPNV como son Rotavirus A y el virus de la Bursitis Infecciosa del pollo; así como virus no relacionados. A su vez, se llevó a cabo la inoculación viral en muestras de tejido en diluciones decrecientes para determinar el grado de sensibilidad. Los resultados fueron determinados a partir de los valores del Ciclo Umbral (Ct) y temperatura de Melting (Tm) de los productos amplificados. La prueba fue capaz de detectar al virus hasta concentraciones de 102 UFP/ml. Las 121 muestras de campo resultaron negativas a IPNV; los animales enfermos evidenciaron etiologías de tipos bacterianos y no virales. Los resultados obtenidos determinaron una especificidad del 100% y una sensibilidad del 100%; a su vez, los valores predictivo positivo y predictivo negativo resultaron en 100%. La técnica de RT-PCR en tiempo real estandarizada en el laboratorio representa una técnica valiosa para el diagnóstico de IPNV. Palabras Clave: Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa, IPNV, RT-PCR, RT-PCR tiempo real